檸檬酸鹽緩沖液,0.5M,pH4.0實(shí)驗(yàn)原理：

RNA是一類極易降解的分子，要得到完整的RNA必須*大限度地抑制提取過程中內(nèi)源性及外源性核糖核酸酶對(duì)RNA的降解。高濃度變性劑TRIzol，可溶解蛋白質(zhì)，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使核蛋白與核酸分離，失活RNA酶，檸檬酸鹽緩沖液,0.5M,pH4.0所以RNA從細(xì)胞中釋放出來時(shí)不被降解。細(xì)胞裂解后，除了RNA，還有DNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片，通過氯仿、異丙醇等有機(jī)溶劑處理得到純化、均一的總RNA。

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1．掌握真核生物細(xì)胞基因組RNA制備和定量的基本方法。

2．掌握反轉(zhuǎn)錄PCR的原理及實(shí)驗(yàn)方法。

3．掌握PCR技術(shù)原理和基本實(shí)驗(yàn)步驟。

實(shí)驗(yàn)儀器和材料：

低溫冷凍離心機(jī)、烤箱、制冰機(jī)、移液器、冰箱，水平電泳槽、電泳儀、勻漿器、TRIzol、 氯仿、異丙醇、75％乙醇（DEPC H 2 O）配制、DEPC H 2 O

檸檬酸鹽緩沖液,0.5M,pH4.0實(shí)驗(yàn)步驟：

1. 取50－100mg（新鮮或－70℃及液氮中保存的組織均可）置1.5ml勻漿器中，加入1ml TRIzol充分勻漿，室溫靜置5min。

2. 加入0.2ml氯仿，振蕩15s，靜置2min。

3. 4℃離心，12000g×15min，取上清置另一1.5ml離心管中。

4. 加入0.5ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min。

5. 4℃離心，12000g×10min，棄上清。

6. 加入1ml75％乙醇，輕輕洗滌沉淀。4℃離心，7500g×5min，棄上清。

7. 晾干，加入適量的DEPC H 2 O溶解（65℃促溶10～15min）。

8. 檸檬酸鹽緩沖液,0.5M,pH4.0快速電泳檢測RNA完整性。