Chocolate agar堿變性提取質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。在pH高達(dá)12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離，當(dāng)以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來的構(gòu)型，Chocolate agar保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。

Chocolate agar注意事項(xiàng)     

1.  當(dāng)RNApure Reagent用量少于2ml時(shí)建議使用清潔的一次性的聚丙烯材質(zhì)試管。

2.  當(dāng)RNApure Reagent用量較大時(shí)，可以使用玻璃試管(Corex)或聚丙烯材質(zhì)試管，事先檢驗(yàn)以確保該試管可以耐受加入RNApure Reagent和氯仿后12,000×g的離心力。不可使用有裂縫或者破損的試管。

3.  離心前小心平衡試管。

4.  離心前玻璃管口必須蓋上鋁箔并用石蠟?zāi)し饪?，聚丙烯管必須蓋緊。

5.  從少量的組織(1~10mg)或細(xì)胞(102~104)中分離RNA樣品：調(diào)整樣品體積到0.25ml，往組織或細(xì)胞中加入0.75ml RNApure Reagent。Chocolate agar待樣品裂解后，加入氯仿并進(jìn)行步驟2中的抽提操作。在用異丙醇沉淀RNA之前，加入5~10μg無RNA酶的glycogen作為水樣層的載體。為降低其黏度在加入氯仿前用26號(hào)注射器抽吸兩次以切斷基因組DNA。Glycogen會(huì)留在水樣層中并和RNA共析出。在濃縮到4mg/ml之前它不會(huì)抑制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)**鏈的合成也不會(huì)抑制PCR。

6.  在勻漿化后和加入氯仿之前，樣品可以在–60~–70°C保存至少一個(gè)月。RNA沉淀（步驟4，RNA漂洗）放置于75%的乙醇在2~8°C至少可以保存一周，在–5~–20°C下至少可保存一年。

7.  臺(tái)式離心機(jī)Chocolate agar*大能達(dá)到2,600×g的離心力的，如果將離心時(shí)間延長到30~60分鐘可以滿足步驟2和步驟3中的操作。